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Você sabia? O anticorpo monoclonal anti-CD-38 (Daratumumab) e a interferencia nos testes imuno-hematológicos

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DARATUMUMAB : Um novo tratamento para pacientes com Mieloma Múltiplo e as interferências nos testes pré-transfusionais

Ana Lúcia Girello[1] e Regina Aparecida Cardoso[2]
Consultoras Técnico-científicas do Laboratório de Referência em Imuno-hematologia da REMLAB- São Paulo (SP)

[1] Ana Lúcia Girello: Publicitária e Biomédica, Mestre em Análises Clínicas, Diretora da empresa Bioline Assessoria, Consultoria e Treinamento Ltda. Autora do livro “Fundamentos da Imuno-hematologia Laboratorial”(Ed. Senac, 4a ed., 2016). Consultora Científica em Imuno-hematologia para a REMLab Central Sorológica e Imuno-hematológica. Site: www.byoline.com.br E-mail: bioline@globo.com

[2] Regina Aparecida Cardoso: Biomédica, Mestre em Biotecnologia, Diretora da empresa HEMOBAC. Consultora Científica em Imuno-hematologia para a REMLab Central Sorológica e Imuno-hematológica. E-mail: rcardoso@uol.com.br

 

O que é o Mieloma Múltiplo?

O Mieloma Múltiplo (MM) é uma doença neoplásica que afeta um clone de plasmócitos na Medula Óssea, que passa a proliferar incontrolavelmente e produzir grande quantidade de imunoglobulinas anormais, denominadas Proteina M ou paraproteínas. Acomete especialmente pessoas idosas (acima de 65 anos), sendo rara em pessoas com menos de 35 anos.

O doente apresentará alterações na produção das outras células do sangue, sendo observadas alterações no hemograma, como anemia, plaquetopenia e leucopenia, levando progressivamente a um quadro de imunossupressão. Considerada uma doença incurável, porém tratável, cursa com alterações no metabolismo dos ossos por infiltrações das células malignas, ocasionando níveis elevados de cálcio sérico provenientes destas lesões ósseas, e levando a uma consequente insuficiência renal.

O tratamento convencional consiste de utilização de corticosteroides, quimioterapia, uso de drogas imunomodulatórias, como talidomida ou lenalidomida (esta ultima ainda não disponível no Brasil), inibidores de proteossoma na célula tumoral (como o ixazomib oral), e a radioterapia para diminuir as dores provenientes das lesões ósseas. Ainda, alguns doentes podem ser candidatos a receber transplante de medula óssea autóloga.

Sobre o Daratumumab (DARA) 

É um novo medicamento injetável com administração intravenosa, contendo anticorpo monoclonal IgG1κ  que reconhece uma proteína transmembranar (CD38) altamente expressa nas células malignas características do mieloma múltiplo, e também expressa em muitos tipos de células normais, como linfócitos T, B, NK, plasmócitos e glóbulos vermelhos.

O mecanismo de ação do DARA: liga-se à proteína CD38 das células neoplásicas, inibindo seu crescimento e induzindo à morte celular.

Esta imunoterapia é bastante promissora para tratamento dos pacientes refratários às terapêuticas convencionais: inicialmente aprovada na Europa pela European Medicines Agency; mais tarde aprovada nos estados Unidos (em 16/11/2015) pelo o FDA (Food and Drugs Administration), e recentemente no Brasil pela ANVISA (em 30/01/2017), com as seguintes indicações terapêuticas abaixo citadas: [3]

O daratumumabe foi aprovado na Anvisa para duas indicações terapêuticas específicas. Conheça: 

  • em combinação com bortezomibe e dexametasona, para o tratamento de pacientes com mieloma múltiplo que receberam pelo menos um tratamento prévio;  
  • em monoterapia, para o tratamento de pacientes com mieloma múltiplo que receberam pelo menos três linhas de tratamento prévio, incluindo um inibidor de proteassoma (IP) e um agente imunomodulador, ou que foram duplamente refratários a um IP e um agente imunomodulador 

Dr. Angelo Maiolino, chefe do Serviço de Hematologia e Transplante de Medula Óssea da Faculdade de Medicina da UFRJ informou que o Brasil fará parte de um estudo multicêntrico onde o grande objetivo será comparar os benefícios dos anticorpos monoclonais (daratumumab e o elotuzumab, este último ainda em fase de aprovação pelo FDA) como agentes de primeira linha comparados ao tratamento convencional, em pacientes não elegíveis ao transplante.[4]

DARA e a interferência nos testes imuno-hematológicos

Recentemente, foi observado que o soro dos pacientes submetidos ao tratamento com imunoterapia com anti-CD38 apresentava um efeito de panreatividade nos testes imuno-hematológicos de detecção de anticorpos séricos in vitro, podendo mascarar a presença de aloanticorpos clinicamente significantes eventualmente presentes na amostra do paciente.

Resultados positivos foram observados em pesquisa (triagem) e identificação de anticorpos irregulares (painel de hemácias), assim como nas provas cruzadas, em fase de antiglobulina humana, utilizando-se quaisquer meios (como salina, PEG, albumina ou LISS), e em quaisquer metodologias (seja tubos de ensaio, gel-teste ou fase sólida). Isto ocorre pois o anti-CD38 reconhece esta proteína também presente nas membranas eritrocitárias.

Esta positividade pode persistir até 6 meses a partir da descontinuação do tratamento com DARA!

Só não foi observada interferência nos testes de tipagem ABO e Rh(D) na fase de leitura imediata (temperatura ambiente).

Então, como proceder para eliminar esta interferência nos testes pré-transfusionais?

A proteína CD38 possui 5 pontes dissulfídicas. O tratamento com solução de Ditiotreitol 0,2M (DTT) desnatura estas proteínas.

Portanto: As hemácias-teste poderão ser tratadas por uma solução de Ditiotreitol (DTT) 0,2M.

Observação: A literatura também cita outras técnicas: a possibilidade de tratamento das hemácias com tripsina. Testagem com hemácias obtidas de cordão umbilical também podem ser incluidas na testagem do soro, já que possuem pequena quantidade de CD38 expresso. Neutralização do anti-CD38.

 

Validação da Técnica de DTT 0,2M para eliminar a panreatividade causada pelo anti-CD38 [5]

Um grande estudo multicêntrico- Biomedical Excellence for Safer Transfusion (BEST) Collaborative– foi conduzido incluindo-se 25 laboratórios de serviços de hemoterapia de 11 países de 5 continentes (Brasil sendo representado por dois laboratórios!), para validar a metodologia do uso da solução de DTT 0,2M para eliminar a interferência do DARA nos testes pré-transfusionais. O banco de sangue do Brigham and Women’s Hospital (BWH) serviu como centro de coordenação do estudo e foi responsável pela elaboração, rotulagem, validação, envio e rastreamento de todas as amostras do estudo e pela coleta e analise dos resultados. (Não deixe de ler o artigo original citado em nossas referencias!)

Foram enviadas duas amostras distintas para cada laboratório para realização dos testes de validação da técnica de DTT 0,2M. Testes de pesquisa de anticorpos irregulares foram realizados, pelas metodologias disponíveis e usuais em cada laboratório, utilizando-se inicialmente as hemácias de triagem não tratadas e repetindo-se, posteriormente, usando as hemácias tratadas pela solução DTT 0,2M. Caso a pesquisa de anticorpos resultasse negativa, o estudo estava completo. Em caso de positividade, os laboratórios procederam a identificação de anticorpos pelo painel de hemácias também tratadas por DTT 0,2M.

O protocolo resumido: 

–  Preparou-se a solução a 0,2 mol/L de DTT diluindo-se 1g de DTT (Sigma) em 32 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 8,0.

–  Hemácias de fenótipo K+, e outras fenótipo E+ foram utilizadas como controles, para verificar se o tratamento com DTT desnaturaria o antígeno K, enquanto preservaria o antígeno E.

–  As hemácias reagentes (100 μL de suspensão a 3% -5%) foram lavadas quatro vezes com PBS (pH 7,3)

–  Adicionou-se a cada alíquota 400μL de DTT 0,2 mol/L.

–  As hemácias foram incubadas a 37°C durante 30 minutos com homogeneização periódica por inversão (três a quatro vezes durante a incubação).

–  As hemácias foram então lavadas quatro vezes com PBS (pH 7,3) e utilizadas para testes subsequentes realizando-se as devidas suspensões de acordo com o método empregado, e adicionando-se o soro do paciente.

 

Princípio da técnica:

A solução de DTT 0,2M remove aproximadamente 92% de CD38 presentes nas membranas eritrocitárias. Dessa forma, sem a presença do antígeno CD38, o imunoterápico livre no soro perde seu sítio de ligação, e como resultado teremos pesquisas de anticorpos irregulares negativas, assim como todas as provas de compatibilidade (provas cruzadas) em fase de antiglobulina humana.

Como o DTT desnatura a proteína CD38, o anticorpo anti-CD38 não deverá causar interferência, e eventuais aloanticorpos séricos “mascarados” poderão ser evidenciados.

IMPORTANTE: O DTT tem a propriedade de desnaturar antígenos de alguns sistemas, entre eles antígenos do sistema K. Por isso, recomenda-se selecionar hemácias de fenótipo K (K1) negativo para as provas cruzadas, a menos que o receptor seja sabidamente K+

Outros antígenos de grupos sanguíneos também são desnaturados/ enfraquecidos por ação do DTT: GE, LW, YT, KN, DO, LU, JMH, IN, CROM (expressão diminuída). Dessa forma, não se pode afastar a presença de anticorpos dirigidos contra esses sistemas, após realizados os testes com hemácias tratadas. Porém, sabemos, que a ocorrência dos mesmos é mais rara.

Conclusão: Este estudo de validação internacional demonstrou que o método DTT foi adequado e reprodutível para eliminar a interferência do DARA nos testes pré-transfusionais. Concluiu, também, que pela capacidade do DTT em desnaturar os antígenos Kell, unidades de concentrados de hemácias fenótipos K- devem ser fornecidas aos receptores (a menos que o paciente seja K +). Concluiu, então, que a solução de DTT 0,2M pode ser adotada com sucesso por serviços de transfusão em todo o mundo.

Com base nestes estudos, finalmente a AABB (American Association of Blood Banks) recomendou, em Boletim emitido em janeiro de 2016, que seja coletada uma amostra prévia do paciente que irá iniciar o tratamento com DARA, para que o serviço de hemoterapia proceda, previamente às transfusões, as pesquisas imuno-hematológicas, como tipagem ABO, Rh(D), pesquisa de anticorpos irregulares, fenotipagem eritrocitária, e eventualmente a genotipagem, para que posteriormente não ocorram atrasos no atendimento hemoterápico, além de evitar erros na identificação dos anticorpos irregulares por interferência do anti-CD38.

Disponível em: https://www.aabb.org/programs/publications/bulletins/Documents/ab16-02.pdf

 

 

[3] http://portal.anvisa.gov.br/noticias/-/asset_publisher/FXrpx9qY7FbU/content/novo-tratamento-de-cancer-e-aprovado-pela-anvisa/219201/pop_up?_101_INSTANCE_FXrpx9qY7FbU_viewMode=print&_101_INSTANCE_FXrpx9qY7FbU_languageId=pt_BR Acesso em agosto, 2017.

[4] http://www.onconews.com.br/site/noticias/noticias/ultimas/1615-fda-aprova-daratumumab-em-mieloma-m%C3%BAltiplo.html Acesso em agosto, 2017.

[5] Chapuy, C. I., Aguad, M. D., Nicholson, R. T., AuBuchon, J. P., Cohn, C. S., Delaney, M., Fung, M. K., Unger, M., Doshi, P., Murphy, M. F., Dumont, L. J., Kaufman, R. M. and the DARA-DTT Study Group* for the BEST Collaborative (2016), International validation of a dithiothreitol (DTT)-based method to resolve the daratumumab interference with blood compatibility testing. Transfusion, 56: 2964–2972. doi:10.1111/trf.13789

 

REFERENCIAS UTILIZADAS E RECOMENDADAS:

Chapuy, C. I., Aguad, M. D., Nicholson, R. T., AuBuchon, J. P., Cohn, C. S., Delaney, M., Fung, M. K., Unger, M., Doshi, P., Murphy, M. F., Dumont, L. J., Kaufman, R. M. and the DARA-DTT Study Group* for the BEST Collaborative (2016), International validation of a dithiothreitol (DTT)-based method to resolve the daratumumab interference with blood compatibility testing. Transfusion, 56: 2964–2972. doi:10.1111/trf.13789

 

Immunohematology. 2017 Jan;33(1):22-26.Use of standard laboratory methods to obviate routine dithiothreitol treatment of blood samples with daratumumab interference.

Lintel NJ1Brown DK2Schafer DT3Tsimba-Chitsva FM4Koepsell SA5Shunkwiler SM6

 

Saiba mais sobre o Mieloma Multiplo: site da ABRALE

http://www.abrale.org.br/2016-04-11-14-47-03/tratamento

Artigo: Jornal O Estado de São Paulo, por Dr. Nelson Hamerschlak :

http://www.brazilhealth.com/Visualizar/Artigo/18/Mieloma-Multiplo

 

Video YouTube sobre DARATUMUMAB e interferencia em testes imuno-hematológicos: Veja o video (em ingles).

 

Sobre a técnica de DTT:

SLIDES: http://ilabb.org/Docs/2017_PhyllisUnger_CaseStudies/DTT_Treated_Reagent_Red_Cells_UCM_MStewart_2017.pdf

Suplemento da Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia- Congresso HEMO 2016 (Florianópolis, 2016)

Sobre o darzalex: https://www.darzalex.com/